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淋巴成纤维细胞培养方法

浏览次数:483发布日期:2024-11-01

淋巴成纤维细胞培养方法

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%胰酶(T25瓶),使胰酶覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%胰蛋白酶(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
4、细胞计数与活力评估:在进行细胞传代、复苏或冻存前,进行细胞计数与活力评估是至关重要的步骤。①取少量细胞悬液,与等体积的0.4%台盼蓝溶液混合,静置2-3分钟。②使用血细胞计数板,在显微镜下计数活细胞(未被台盼蓝染色的细胞)与死细胞(被台盼蓝染成蓝色的细胞)。③计算细胞总数及活力百分比(活细胞数/总细胞数×100%)。确保细胞活力高于90%方可用于后续实验,以保证实验结果的准确性和可靠性。

5、培养环境优化:淋巴成纤维细胞的培养还需注意培养环境的细节优化。①维持培养箱内的温度恒定在37℃,湿度饱和,并通入5% CO₂以保持适宜的pH值。②定期更换培养基,一般为每2-3天一次,以去除代谢产物,补充营养物质。③使用经过灭菌处理的器材和试剂,减少污染风险。通过这些措施,可以进一步提升细胞的生长状态,促进实验的顺利进行。


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