哺乳动物源性成分探针法PCR荧光定量试剂盒操作程序

哺乳动物源性成分探针法PCR荧光定量试剂盒操作程序如下：

一、实验前准备

严格划分样本处理区、试剂准备区、扩增区三个独立操作区域，全程避免交叉污染。

提前将试剂盒组分从-20℃取出解冻，短暂离心后置于冰上备用。

准备无酶吸头、PCR管等耗材，提前对超净台进行紫外消毒30分钟。

二、样本处理

采用病毒RNA/DNA提取试剂盒，完成待检样本的核酸提取。

阴性质控品、阳性质控品无需提取，可直接取用。

同步设置样本制备阴性对照，和待测样本同步完成全部提取流程。

三、扩增试剂准备

按N+1份（N=阴性质控+待检样本+阳性质控）的总量，配制反应预混液。

每20μL体系包含19μL PCR反应液、1μL PCR酶，充分混匀后短暂离心。

将预混液分装至各PCR反应管中，完成后转移至样本处理区。

四、加样操作

向各反应管中分别加入5μL待检样本核酸提取物、阴性质控品、阳性质控品。

同时设置无模板阴性对照，用5μL无菌水替代模板加入对应反应管。

盖紧管盖，6000rpm离心10s，转移至扩增区。

五、PCR扩增

按试剂盒说明书设置扩增程序，完成变性、退火、延伸的循环扩增。

普通PCR完成后进行凝胶电泳，读取条带结果；荧光定量PCR直接读取扩增曲线与Ct值。

六、结果判读

阳性质控出现预期扩增条带/符合要求的Ct值，所有阴性对照无扩增，实验整体有效。

待测样本出现目标大小的特异性条带，判定为阳性；无扩增条带则判定为阴性。

若阴性对照出现扩增，说明存在污染，整批次实验结果无效，需排查后重测。

七、后续处理

所有废弃样本、耗材按生物危害废物规范处理。

实验结束后对各操作区进行全面消毒，避免残留核酸污染后续实验。