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常遇到菌落PCR试剂盒问题疑难解答

浏览次数:93发布日期:2021-03-19
   菌落PCR试剂盒是筛选重组子的有效方法,可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。但由于它直接以E.coli菌落为PCR而菌落中常常含有未进入细菌的、来源于连接反应的载体DNA和插入片段,所以十分容易产生假阳性。
  菌落PCR试剂盒常遇到的疑难解答:
  Q:样品没有扩增产物而阳性对照有产物出现。
  A:可能是样品DNA溶液中含有的细胞裂解物抑制了PCR扩增。建议将样品DNA溶液用水稀释5-100倍后再扩增(两个梯度)。
  Q:样品和阳性对照都没有扩增产物出现。
  A:重新设计PCR反应参数或引物。
  Q:阳性对照有大小不同的两条扩增产物出现。
  A:如果用户自备的引物一条识别载体,一条识别插入片段,模板又是连接反应液,则出现此情况属于正常,因为两种插入方向的DNA在连接反应液里面都存在。
  Q:菌落PCR试剂盒阴性对照有扩增产物出现。
  A:如果是引物二聚体,实验结果有效。如果片段跟阳性对照一样,可能有污染,其他阳性结果也可能是污染引起,建议找到污染原因后再继续实验。
  Q:一个普通菌落中一般有多少残留的未转化的DNA?
  A:如果使用100ng的插入片段进行连接反应,用1/10的连接反应液进行转化,再用1/10的转化菌液涂盘,有一半插入片段进入细菌计算,则有0.5ng的插入DNA片段游离在细胞外,分布培养皿表面。一个培养皿的表面积一般为55cm2,一个直径为5mm的菌落(面积约0.2mm2)则平均可能含有3pg左右的游离状的插入DNA片段,如果使用插入片段专一性的PCR引物,则足够在PCR反应中产生假阳性。
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