常遇到菌落PCR试剂盒问题疑难解答

　　菌落PCR试剂盒常遇到的疑难解答：

　　Q：样品没有扩增产物而阳性对照有产物出现。

　　A：可能是样品DNA溶液中含有的细胞裂解物抑制了PCR扩增。建议将样品DNA溶液用水稀释5-100倍后再扩增（两个梯度）。

　　Q：样品和阳性对照都没有扩增产物出现。

　　A：重新设计PCR反应参数或引物。

　　Q：阳性对照有大小不同的两条扩增产物出现。

　　A：如果用户自备的引物一条识别载体，一条识别插入片段，模板又是连接反应液，则出现此情况属于正常，因为两种插入方向的DNA在连接反应液里面都存在。

　　Q：菌落PCR试剂盒阴性对照有扩增产物出现。

　　A：如果是引物二聚体，实验结果有效。如果片段跟阳性对照一样，可能有污染，其他阳性结果也可能是污染引起，建议找到污染原因后再继续实验。

　　Q：一个普通菌落中一般有多少残留的未转化的DNA？

　　A：如果使用100ng的插入片段进行连接反应，用1/10的连接反应液进行转化，再用1/10的转化菌液涂盘，有一半插入片段进入细菌计算，则有0.5ng的插入DNA片段游离在细胞外，分布培养皿表面。一个培养皿的表面积一般为55cm2，一个直径为5mm的菌落（面积约0.2mm2）则平均可能含有3pg左右的游离状的插入DNA片段，如果使用插入片段专一性的PCR引物，则足够在PCR反应中产生假阳性。