RT-PCR试剂盒样品制备操作步骤

　　RT-PCR试剂盒样品制备：

　　本试剂盒是把RNA合成cDNA，然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。

　　因此，在实验中需要采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

　　【使用器具】

　　尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。

　　（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。

　　（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

　　RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

　　【试剂配制】

　　用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60min.）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

　　RT-PCR试剂盒实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

　　【制备方法】

　　使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RTPCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸肌法）制备的高纯度RNA。

　　使用Catrim ox-14MRNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa CodeDWA005）可从血液中快速提取高纯度的TotalRNA。

　　使用本试剂盒进行RT-PCR反应时，每次反应所需的适量TotalRNA约为500ng。