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RT-PCR试剂盒样品制备操作步骤

浏览次数:77发布日期:2021-07-09
  RT-PCR试剂盒样品制备:
  本试剂盒是把RNA合成cDNA,然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量,而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。
  因此,在实验中需要采取以下措施:戴一次性干净手套;使用RNA操作专用实验台;在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
  【使用器具】
  尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理。
  (1)用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时。
  (2)然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
  RNA实验用的器具和仪器建议专门使用,不要用于其它实验。
  【试剂配制】
  用于RNA实验的试剂,须使用干热灭菌(180℃,60min.)或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可使用RNA实验用的一次性塑料容器),使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。
  RT-PCR试剂盒实验用的试剂和无菌水都应专用,避免混用后交叉污染。
  【制备方法】
  使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RTPCR反应的RNA(只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应)。但为了保证实验的成功率,建议使用GTC法(异硫氰酸肌法)制备的高纯度RNA。
  使用Catrim ox-14MRNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa CodeDWA005)可从血液中快速提取高纯度的TotalRNA。
  使用本试剂盒进行RT-PCR反应时,每次反应所需的适量TotalRNA约为500ng。
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