RT-PCR试剂盒使用注意事项

　　RT-PCR试剂盒反应就是从RNA反转录至cDNA，然后通过PCR反应扩增cDNA的过程。试剂盒采用了一步反应法完成整个RT-PCR反应，即RNA-cDNA-PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应过程中不需增加额外的步骤，就可完成整个RT-PCR反应，同时整个反应系统且含有电泳时所需要的试剂，可直接上样电泳。本试剂盒具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点，可适用于各种动、植物、病毒RNA的PCR检测。

　　RT-PCR试剂盒备注：

　　1.用户可根据自己的情况调整优化PCR反应扩增参数：

　　·退火温度：可根据实际情况适当地提高或降低退火温度（50℃~65℃）。

　　·延伸时间：延伸时间因目的序列长度的不同而不同

　　·循环次数：cDNA量较少时，循环次数可增加为40~50次

　　·调整镁离子的浓度

　　2.用户可根据本试剂盒提供的β-actin引物（阳性对照）验证RT-PCR体系是否良好（选做）：

　　1.使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；

　　2.取灭过菌且无核酸酶的0.2mlPCR管，依次加入。

　　RT-PCR试剂盒使用注意事项：

　　1.平台效应：PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

　　2.防止DNA的污染：①采用DNA酶处理RNA样品；②在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

　　3.RNA提取试剂盒：目前试剂公司有多种RNA提取试剂盒、cDNA试剂盒、PCR试剂盒以及RT-PCR试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。如果使用试剂盒，具体操作步骤请参照试剂盒说明书。