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RT-PCR试剂盒使用注意事项

浏览次数:87发布日期:2021-08-06
  RT-PCR试剂盒反应就是从RNA反转录至cDNA,然后通过PCR反应扩增cDNA的过程。试剂盒采用了一步反应法完成整个RT-PCR反应,即RNA-cDNA-PCR反应操作在同一反应体系中进行,反应过程中不需增加额外的步骤,就可完成整个RT-PCR反应,同时整个反应系统且含有电泳时所需要的试剂,可直接上样电泳。本试剂盒具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点,可适用于各种动、植物、病毒RNA的PCR检测。
  RT-PCR试剂盒备注:
  1.用户可根据自己的情况调整优化PCR反应扩增参数:
  ·退火温度:可根据实际情况适当地提高或降低退火温度(50℃~65℃)。
  ·延伸时间:延伸时间因目的序列长度的不同而不同
  ·循环次数:cDNA量较少时,循环次数可增加为40~50次
  ·调整镁离子的浓度
  2.用户可根据本试剂盒提供的β-actin引物(阳性对照)验证RT-PCR体系是否良好(选做):
  1.使用前每个组份轻轻混匀,然后2000rpm离心20s;
  2.取灭过菌且无核酸酶的0.2mlPCR管,依次加入。
  RT-PCR试剂盒使用注意事项:
  1.平台效应:PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
  2.防止DNA的污染:①采用DNA酶处理RNA样品;②在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。
  3.RNA提取试剂盒:目前试剂公司有多种RNA提取试剂盒、cDNA试剂盒、PCR试剂盒以及RT-PCR试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。如果使用试剂盒,具体操作步骤请参照试剂盒说明书。
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